任妙珍，董凯麟，张 剑，陈之端，苏俊霞
(1.山西师范大学生命科学学院，太原 030092；
2.中国科学院植物研究所系统与进化植物学国家重点实验室，北京 100093)
竹叶花椒(ZanthoxylumarmatumDC.)属于芸香科(Rutaceae)花椒属(ZanthoxylumL.)，俗称“藤椒”，是一种落叶小乔木或灌木，枝具宽而扁锐的刺，全株有浓烈辛香味，主要分布在我国秦岭以南的广大西南区域[1].由于其清香浓郁的特殊风味，竹叶花椒的干燥成熟果皮，常用作风味调节剂和防腐剂，是中国美食中不可或缺的一种调料.它也是一种重要的药用植物，根、茎、叶、果实等部位都可入药，可以辅助治疗胃痛、牙痛、肠内蠕虫及发热、风湿等；
其提取的化合物具有消炎、杀菌和抗氧化的作用[2-4].竹叶花椒不仅是我国传统的香料、油料和药用树种，也是重要的生态经济树种，深受广大人民的喜爱.其中含有丰富的挥发油，主要为小分子醇类或萜类物质[5].
特化次生代谢物的出现，提高了植物适应环境的能力[6].在植物组织中，挥发性有机物(volatile organic compounds, VOCs)的合成具有重要的生物学功能，包括抵抗病原菌，寄生生物和食草动物等.根据其来源，VOCs又可分为萜类、苯类芳烃和脂肪酸衍生物，其中萜类占据了大多数[7].萜类是天然化合物中规模最大，结构最多样的一类次生代谢物[8].萜类化合物源自甲羟戊酸(MVA pathway)途径和甲基赤藓糖磷酸酯途径(MEP pathway)产生的化合物和衍生物，分子骨架基于异戊二烯或其异构体二甲基烯丙基焦磷酸C5单元，包含倍半萜、单萜、二萜、三萜等几种类型[9].萜类化合物在植物生理和生化中扮演了重要的角色，例如光合作用、电子传递、发育调控等[10].根据植物中萜类化合物的作用可将其分为两大类：初级代谢产物和次级代谢产物，例如赤霉素、脱落酸、类胡萝卜素、甾醇等为重要的初级代谢物，可调节细胞伸长和植物生长，参与光合作用以及控制膜流动性等；
植物中大多数萜类是次生代谢物，如青蒿素，紫杉醇，棉酚等，在植物与环境相互作用中起着关键作用，并且具有重要的药用价值.萜类合成依赖于萜类合成酶(Terpene synthase, TPS)，萜类合成酶的多样性造就了萜类的多样性，根据生成的产物不同，可将其分为单萜合成酶、倍半萜合成酶、二萜合成酶等.根据植物TPS基因家族的系统发育关系，前人将该家族划分为8个亚家族：TPS-a，TPS-b，TPS-c，TPS-d(裸子植物特有)，TPS-e，TPS-f，TPS-g，和TPS-h(卷柏属特有)[11].为了适应特殊的生态位，例如吸引传粉者，散播种子，对抗病原菌，防止食草动物的啃食等，大部分植物的萜类物质会发生谱系特异进化，在各个亚家族中发生不同程度的扩张和变异[10,12,13].萜类合成酶TPS基因家族在多种植物中都已经被鉴定，例如在拟南芥[Arabidopsisthaliana(L.)Heynh.]中鉴定到32条，在玉米(ZeamaysL.)中鉴定到30条[14]，在水稻(OryzasativaL.)中鉴定到34条[11]，在陆地棉(GossypiumhirsutumL.)中鉴定出41条[15].然而，关于有名的香料植物竹叶花椒萜类合成酶基因家族的成员鉴定与功能研究却还没有相关报道.近年来随着基因组测序技术的成熟，竹叶花椒基因组测序也已经完成[16].因此，本研究开展了竹叶花椒TPS基因家族的鉴定与表达分析，利用生物信息学方法深入解析了竹叶花椒TPS基因家族的进化和表达模式，为进一步探索竹叶花椒TPS基因的功能提供了参考，为深入探究竹叶花椒挥发油的合成调控提供重要的目标基因.
2.1 材 料
竹叶花椒的全基因组数据，相关蛋白序列和GFF文件从Figshare(https://figshare.com/articles/dataset/The_chromosome-level_genome_assembly_of_Sichuan _pepper/14400884/1)网站下载获取.拟南芥(A.thaliana)与甜橙[Citrus sinensis(L.)Osbeck]的蛋白序列分别来自于TAIR10(https://www.arabidopsis.org/)和 Phytozome13(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/info/Csinensis_v1_1)网站.
2.2.1 基因家族成员的鉴定和序列分析 根据TPS蛋白包含保守N端结构域Terpene_synth(PF01397)和C端结构域Terpene_synth_C(PF03936)的特征，从Pfam34.0网站(http://pfam.xfam.org/)[17]下载这两个隐马尔科夫模型文件.分别用PF01397和PF03936隐马尔科夫模型文件对竹叶花椒蛋白数据进行hmmsearch，使用默认阈值10.0，可以在初始搜索时覆盖所有可能的TPS基因，最终得到两个序列集，对这两个数据集合并去冗余，得到hmmsearch的数据集(1).为了使数据集更完善，使用前人已鉴定的拟南芥TPS蛋白序列[18]，进行blastp搜索竹叶花椒的蛋白库，获得竹叶花椒同源序列数据集(2).将数据集(1)和(2)合并去冗余，并在Pfam34.0网站(http://pfam.xfam.org/)[17]对合并得到的数据集进行结构域核查，获得最终的竹叶花椒TPS基因列表.甜橙中的TPS基因序列采用同样方法获得.等电点，分子量等理化性质分析用perl脚本计算完成.亚细胞定位使用WoLF PSORT网站(https://wolfpsort.hgc.jp/)进行预测.
2.2.2 系统发育分析 在MAFFT v7在线网站(https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/)[19]对竹叶花椒、甜橙、拟南芥和三条经过功能验证的胡椒木的TPS蛋白序列进行多序列比对，比对好的序列在IQ-tree在线网站(http://iqtree.cibiv.univie.ac.at/)[20]上进行系统发育树构建，Bootstrap值设置为1000.竹叶花椒TPS基因类别划分根据2011年Chen的系统发育分类标准[11].
2.2.3 基因结构及蛋白保守基序分析 使用在线网站MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)[21]对ZaTPSs保守基序进行分析，预测值设置为20个；
利用竹叶花椒基因组的GFF文件和蛋白序列，采用TBTOOLS[22]中的Gene Structure View 功能对竹叶花椒TPS基因结构和保守基序进行可视化绘图.
2.2.4 染色体定位及基因重复类型分析 染色体定位使用以下几个文件：MCScanX中的duplicate_gene_classifier程序生成的串联重复对文件，染色体序列长度文件，GFF文件以及竹叶花椒的TPS基因ID列表，运行脚本生成Mapchart所需要的配置文件，在Mapchart软件中进行绘制和美化.竹叶花椒基因重复类型分析采用PGDD(http://chibba.agtec.uga.edu/duplication/)的方法进行本地化分析.从基因组注释文件中提取ZaTPSs基因家族成员的染色体定位信息和相关基因对信息，而后使用MCScanX鉴定ZaTPSs基因的重复类型.
2.2.5 全基因组共线性分析 为了揭示竹叶花椒与其近缘种甜橙及模式植物拟南芥的TPS家族同源基因的共线性关系，比对三者基因组，进行全基因组共线性分析，使用JCVI画图，竹叶花椒、甜橙和拟南芥的TPS基因在共线性块中的连线将会高亮显示.
2.2.6 基因表达模式分析 使用Hisat2软件分别将竹叶花椒的顶芽、幼叶、成熟叶片、叶柄、幼花、种子、果皮、茎和皮刺9个不同组织的转录组数据(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=Zanthoxylum+armatum)，比对到参考基因组上[16]，使用featurecounts R包计算TPM值[23]，分析竹叶花椒TPS家族基因在不同组织中的表达模式，使用TBTOOLS[22]软件中的Heatmap功能完成可视化.
3.1 基因鉴定及理化性质分析
在竹叶花椒基因组中鉴定出53个TPS基因.根据染色体位置信息分别命名，见表1.对ZaTPS蛋白理化性质的分析结果显示，ZaTPS蛋白长度在173～859 aa之间，分子量在20.21～98.44 kD之间，等电点范围在4.87～9.10，其中有52个成员偏酸性，只有1个成员偏碱性，说明ZaTPSs蛋白质在酸性环境下更容易沉淀.亚细胞定位结果显示ZaTPSs大部分分布在叶绿体(49.06%)和细胞质(39.62%)，少部分位于细胞核(9.43%)和线粒体(1.89%)中.
表1 竹叶花椒TPS基因家族成员信息
3.2 基因家族系统发育分析
使用32个拟南芥、28个甜橙和53个竹叶花椒TPS蛋白序列构建系统发育进化树，见图1.三个物种的TPS基因聚为 6 个分支，分别对应TPS基因的6个亚家族：TPS-a，TPS-b，TPS-c，TPS-e，TPS-f和TPS-g，在系统树上每个亚家族的聚类关系都得到了很好的支持.在被子植物中，TPS-a和TPS-b是倍半萜和单萜的主要合成酶.在竹叶花椒中，TPS-a和TPS-b亚家族成员较多，分别为20条和24条，TPS-e和 TPS-f 亚家族中成员最少，只有1条.与之相似，甜橙的TPS-a和TPS-b亚家族成员也较多，分别为15条和9条，TPS-c和TPS-e亚家族成员较少，均为1条，TPS-f亚家族则一条也没有.
图1 竹叶花椒、甜橙和拟南芥TPS蛋白的系统发育树
3.3 基因结构及蛋白保守基序分析
利用MEME在线工具对ZaTPS蛋白序列进行分析，并得到motif保守基序，根据含有保守基序的序列数目和其显著性，依次命名为motif 1至20，见图2.其中motif 1(E-value为7.5e-945)有TPS最典型的保守结构域，“富含天冬氨酸残基的DDxxD”，该残基被认为对金属离子起到结合作用，从而在引导底物催化时发挥重要作用[24]，48个ZaTPSs都含有motif1.Motif 12包含TPS-a和TPS-b的保守基序“RRX8W”.包含Motif 20的序列条数最少，只有9条，都为TPS-b亚家族成员.整体来看，TPS-a 和TPS-b亚家族包含的保守基序较多，TPS-g亚家族保守基序较为一致，猜测TPS-g在竹叶花椒中比较保守.通过竹叶花椒全基因组GFF注释文件和TPS基因家族CDS序列信息，统计外显子和内含子，分析发现53个ZaTPSs均正常编码，但各成员外显子个数存在差异，ZaTPS25外显子数目最多，达到15个.
图2 竹叶花椒ZaTPSs保守基序分布及外显子、内含子分布
3.4 染色体定位及基因重复类型
染色体定位分析结果显示竹叶花椒有44条ZaTPSs不均匀地分布在11条染色体上，结果见图3，剩余的9个基因分布在未挂载到染色体上的片段序列中.其中14号染色体含有的ZaTPS基因最多，且主要为串联重复，呈小型基因簇.16号，24号染色体上都分别发生了不同程度的串联重复.除了标红的几个串联重复基因簇外，还有一些基因分布距离较近，猜测是由比较古老的串联重复形成.TPS基因分布最少的为3号、4号、10号、12号、15号、25号染色体，仅含有1个ZaTPS基因.同时，我们对ZaTPS基因重复类型的分析结果显示，转座重复(TRD)(占24.53%)，串联重复(TD)(占20.75%)和全基因组复制(WGD)(占20.75%)是竹叶花椒TPS基因家族扩张的主要的驱动因素.与甜橙物种分化后，竹叶花椒发生了一次特异的WGD事件[16]，这与WGD对竹叶花椒TPS基因特异扩张的贡献相吻合.
图3 竹叶花椒TPS基因染色体定位
3.5 竹叶花椒、拟南芥及甜橙TPS基因全基因组共线性分析
我们对竹叶花椒、拟南芥及甜橙TPS基因进行了全基因组共线性分析，见图4.竹叶花椒有1条染色体上的TPS基因与拟南芥的TPS基因存在共线关系，有2条染色体与甜橙的TPS基因存在共线关系.与拟南芥相比，竹叶花椒与甜橙具有更近的基因进化关系，共线基因对为14对，而与拟南芥仅有1对.竹叶花椒与甜橙的TPS共线性基因对和竹叶花椒与拟南芥的TPS共线性基因对中，没有共享的ZaTPS基因.
图4 竹叶花椒与甜橙及拟南芥TPS基因共线性分析
3.6 TPS基因在竹叶花椒中的表达模式分析
利用竹叶花椒转录组数据分析ZaTPSs在竹叶花椒顶芽、幼叶、成熟叶片、叶柄、幼花、种子、茎、皮刺和果皮中的表达量，见图5.总体来看，ZaTPSs在竹叶花椒的各个部位都有表达.相比于其他亚家族，TPS-a(log2TPM≈11.86)和TPS-b(log2TPM≈8.42)亚家族平均表达量大于其他亚家族.从各个组织的表达量来看，ZaTPSs在种子、成熟叶片和皮刺中表达量很低或不表达，但皮刺中ZaTPS51却表达异常高(log2TPM≈11.85)，忽略此异常值后，ZaTPSs在幼花组织中平均表达量最突出，尤其是TPS-a(log2TPM≈3.30)，TPS-b(log2TPM≈2.89)和TPS-g(log2TPM≈4.97)亚家族成员，其中TPS-b亚家族的ZaTPS45和ZaTPS36在幼花中的表达量最多.TPS-g亚家族成员在种子、茎和皮刺中不表达，但在幼花中表达总量较明显.除幼花组织外，ZaTPSs在果皮中总体表达量也比较高，最突出的是ZaTPS23(log2TPM≈8.79)，在系统发育树上与其聚为一支的ZaTPS24、ZaTPS42和ZaTPS51在果皮中也表达较高.一些基因在幼叶中有表达但在成熟叶中不表达，如ZaTPS4、ZaTPS6、ZaTPS7等，而一些基因在幼叶和成熟叶中都不表达，如ZaTPS14、ZaTPS44、ZaTPS52等.ZaTPS5、ZaTPS10、ZaTPS44只在茎中有微量表达.
图5 竹叶花椒TPS基因在不同组织中的表达热图(TD，顶芽；
YL，幼叶；
ML，成熟叶；
PT，叶柄；
YF，幼花；
SD，种子；
ST，茎；
PK，皮刺；
HK，果皮)，白色表示没有表达，颜色越深表示表达值越高
TPS基因家族广泛分布于各种生物体内，参与多种生长发育过程，发挥调节功能.目前，已在多种植物中鉴定到了大量的TPS基因家族成员，例如，在花椒(Z.bungeanum)中，鉴定得到70条TPS蛋白，TPS-a和TPS-b亚家族中成员最多，分别为23条和31条[25]，这与我们在竹叶花椒中确定的TPS基因数目大体相近.最近一项基于竹叶花椒转录组数据的研究中，调查了果实中萜类合成通路的关键基因，筛选出28个表达显著上调的关键基因，主要为以下几个基因家族：TPS-like，GGPPS-like，GCPE-like和DXS-like，TPS-like中主要报道了5个TPS-a和TPS-b亚家族成员，但目前并没有针对竹叶花椒TPS基因家族做全面系统性的研究和报道[26,27].鉴于竹叶花椒全基因组数据的发表，本研究开展了竹叶花椒TPS基因家族的鉴定与表达分析，为进一步了解ZaTPSs基因的功能提供了参考.
基于竹叶花椒全基因组数据，共有53条TPS基因被鉴定，其中TPS-a和TPS-b亚家族成员较多，分别为20条和24条，TPS-e和 TPS-f 中成员最少，只有1条，同科植物甜橙在TPS-a和TPS-b亚家族中成员也较多，分别为23条和16条，这一现象符合大多数被子植物中TPS家族分布的规律[14].通过统计竹叶花椒不同亚家族中的基因重复类型情况，我们发现TPS-a亚家族成员中35%来自于转座重复，其次是串联重复(25%)和全基因组复制(25%)，并且该亚家族中转座重复来源的基因表达平均值最高.在TPS-b亚家族中，分散重复来源的基因占据了29.17%，其次是近端重复(20.83%)和转座重复(20.83%)，然而在该亚家族中全基因组复制来源的基因表达平均值最高，其次是散在重复.总体来说，转座重复(24.53%)，串联重复(20.75%)和全基因组复制(20.75%)是竹叶花椒TPS基因家族扩张的主要来源.转座重复是一种通过DNA或RNA复制机制，将基因或基因片段从原来的位置转移到一个新的染色体位置的基因重复类型[28].DNA转座子，例如高粱(sorghum)的CACTA转座元件，能够将基因或基因片段移动到一个新的染色体位置，而基于RNA的转座重复通常是指反转录转座，能够从信使RNA中的多个外显子中产生单外显子进行反转录，反转录产生的基因将会转座到一个新的染色体[29].结合竹叶花椒基因组中含有大量转座元件的结构特征，猜测TPS基因家族扩张受到该结构特征的影响.竹叶花椒与甜橙物种分化后，在大约26.6个百万年前发生过一次物种特异的全基因组复制事件，TPS基因家族的扩张也受到了该事件的促进[16].
萜类生成的前体是异戊烯焦磷酸(IPP)与其异构体二甲基烯丙基二膦酸(DMAPP)，二者分别由发生在细胞质中的甲羟戊酸途径(MVA pathway)和质体中的甲基赤藓糖磷酸酯途径(MEP pathway)生成[9].通过二者的变换结合，在萜类合成酶的作用下，生成一系列中间化合物：牻牛儿基焦磷酸(GPP)，橙花基焦磷酸(NPP)，法尼基焦磷酸(FPP)和牻牛儿牻牛儿基焦磷酸(GGPP)等，最终生成单萜、倍半萜、二萜等[30,31].根据TPS基因家族的亚细胞定位分布模式，倍半萜合酶一般定位于细胞质中，单萜合酶都位于质体中[11,32].亚细胞定位结果显示ZaTPSs大部分定位在细胞质和叶绿体，且TPS-a亚家族蛋白大部分分布于细胞质中，TPS-b亚家族蛋白大部分分布于叶绿体中.众所周知，TPS-a亚家族基因成员编码倍半萜合酶，TPS-b亚家族基因成员编码单萜合酶.这与大部分TPS-a分布在细胞质中，大部分TPS-b分布于叶绿体中的事实相契合.有研究表明，代谢物质合成的基因在染色体的基因排布上并不是随意分散，而是彼此相邻，形成基因簇.萜类合成酶基因形成基因簇有助于基因组合的共遗传和共表达，减少单一通路基因在重组后丢失的可能性[33].染色体定位分析显示，16号染色体和24号染色体上均有串联重复，且16和24号染色体上分布的全为TPS-b亚家族的成员，猜测这加强了基因的共表达.通过观察竹叶花椒TPS基因在不同组织中的表达分析发现，幼花中基因表达最为明显，主要集中于TPS-a，TPS-b和TPS-g三个亚家族.在拟南芥TPS基因功能研究中发现，花器官中检测到的萜类化合物数量最多，与两个功能相关：吸引短距离内的小型昆虫进行传粉，另外可能与防御机制有关[34].玉米中，已有实验证明TPS23能够调控石竹烯的释放，来吸引食草动物的天敌，间接达到驱赶食草动物的目的[35].此外，在棉花中也发现能产生一系列具有杀虫特性的萜类化合物，例如众所周知的棉酚，半棉酚，杀食夜蛾素等[36].这说明萜类作为一种具有重要生物学意义的挥发性有机化合物及其合成相关的TPS基因家族，很有可能在竹叶花椒吸引传粉者、防止食草动物的侵食、防御病原菌等方面起到重要作用，从而来适应特殊的生态位.单萜和倍半萜为小分子萜类，多具有挥发性，在植物体内常以挥发油的形式存在，ZaTPSs基因在果皮中也呈现较高的表达量，猜测与果皮合成、释放挥发性物质有关.竹叶花椒同属植物胡椒木中已有研究验证，ZpTPS1和ZpTPS2能够催化FPP生成倍半萜(C15)，ZpTPS3催化GPP生成单萜(C10).将这三条ZpTPSs蛋白序列加入系统发育分析后发现，ZaTPS12、ZaTPS17-19和ZaTPS50与ZpTPS2聚为一支，得到了较高的支持率，猜测这几个ZaTPSs基因也发挥与ZpTPS2同样的功能.ZpTPS3在植物体内催化形成单萜化合物，在系统进化树上与ZaTPS2、ZaTPS3、ZaTPS30、ZaTPS32-36和ZaTPS45、ZaTPS46聚为一支，这些基因在幼花和果皮中都有表达，但在幼叶和成熟叶中表达有所差别，在成熟叶中不表达，推测这些基因在幼花和果实中功能较为保守，参与幼花和果实单萜类化合物的合成，在叶中不会持续表达.ZaTPS23在果皮中表达量最高，在系统发育树上与其聚为一支的ZaTPS24、ZaTPS42和ZaTPS51在果皮中也表达较高，推测这些成员都参与了果皮中挥发油的合成，后续的功能验证实验可通过基因敲除或过表达实验来观察果皮中挥发油含量的变化[37].
综上所述，基于全基因组数据，本研究全面地鉴定了竹叶花椒中TPS基因家族成员，并对其分类、进化和表达模式进行了深入分析，为后续功能验证实验提供了重要的理论依据，为探究竹叶花椒的生态适应性提供了备选基因，同时为竹叶花椒挥发油应用的研究提供了理论指导.
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