韩承刚，李明显，姬丽芳，沙向阳，郑枫*（1. 中国药科大学药物分析教研室，南京 211198；
2. 浙江省原料药安全研究中心（工艺技术创新平台），杭州 10018；
. 南京锐志生物医药有限公司，南京 211100）
醋酸西曲瑞克（cetrorelix acetate）是一种由10个氨基酸组成的人工合成多肽（绝对构型见图1），是第三代促性腺激素释放激素拮抗剂的代表，可以促排卵获取适当数量的高质量成熟卵母细胞[1]。
图1 西曲瑞克的绝对构型（来源于SciFinder，CAS：120287-85-6）Fig 1 Absolute configuration of cetrorelix acetate（obtained from SciFinder，CAS：120287-85-6）
多肽类药物的生物活性与其氨基酸的手性密切相关。在研究醋酸西曲瑞克一级结构时，需要将多肽在6 mol·L－1的盐酸和110℃条件下反应，该过程可能会引起手性氨基酸发生外消旋化[2-3]。2023年2月药品审评中心（CDE）发布的《化学合成多肽药物药学研究技术指导原则》（试行）版中，对含有手性中心的氨基酸提出需要控制其异构体的要求，因此有必要对多肽合成中手性氨基酸的含量进行研究和控制。目前各国药典未见收载醋酸西曲瑞克的质量标准，关于其质量研究的文献报道也较少[4-6]。
除含芳环结构的氨基酸外，绝大多数氨基酸不含发色基团，因此一般需经衍生化反应处理。柱前衍生化法是利用衍生试剂与氨基酸反应形成非对映体衍生产物的方法。目前已有文献报道了多种衍生化试剂用于氨基酸及胺类化合物的分析检测，包括Marfey试剂、2，4-二硝基氟苯、（FDNB）、荧光胺（FA）、邻苯二甲醛（OPA）、异硫氰酸苯酯（PITC）、丹磺酰氯等[2，7-9]。许多衍生试剂具有一定的局限性，例如不能分离手性氨基酸、衍生物性质不稳定、氨基酸衍生物的可检测性差等[10]。其中Marfey试剂具有强紫外吸收官能团，衍生产物专属性、稳定性强，衍生操作简便等优点[2]。因此本文开发了一种基于Marfey法，采用常规反相HPLC即可对醋酸西曲瑞克水解后10种氨基酸的构型及含量进行测定的方法，以期为醋酸西曲瑞克的结构确证提供依据。
1.1 仪器
Shimadzu LC-20AD XR高效液相色谱仪（配有LC-20AD XR二元泵、SIL-20A XR自动进样器、CTO-20A柱温箱、SPD-20A紫外检测器，日本岛津有限公司）；
Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra AM质谱仪（液相U3000 DAD检测器，美国赛默飞世尔科技）；
XS205DU/A 电子分析天平（d＝0.01 mg），S210-K pH计[梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司]；
TGL-16B高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；
DHG-9070A、DHG-9140A电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。
1.2 试药
L-精氨酸（L-Arg，纯度：99%，批号：H2113190）、D-精氨酸（D-Arg，纯度：98%，批号：D2114171）、3-（3-吡啶基）-D-丙氨酸（D-Pal，纯度：98%，批号：A1921075）、L-酪氨酸（L-Tyr，纯度：98%，批号：E1811066）、D-酪氨酸（D-Tyr，纯度：98%，批号：F2118400）、L-丝氨酸（L-Ser，纯度：99%，批号：H1908018）、D-丝氨酸（D-Ser，纯度＞98.5%，批号：J2123636）、L-脯氨酸（L-Pro，纯度：99%，批号：J2012169）、D-脯氨酸（D-Pro，纯度：99%，批号：B2108066）、L-丙氨酸（L-Ala，纯度：99%，批号：G2110117）、D-丙氨酸（D-Ala，纯度：98%，批号：K1906051）、L-亮氨酸（L-Leu，纯度：99%，批号：K2002002）、D-亮氨酸（D-Leu，纯度：99%，批号：J2111318）、L-4-氯苯丙氨酸（L-Phe，纯度：98%，批号：G1809096）、D-4-氯苯丙氨酸（D-Phe，纯度：95%，批号：E1529076）、L-3-（2-萘基）-丙氨酸盐酸盐（L-Nal，纯度：95%，批号：H2205521）、D-3-（2-萘基）-丙氨酸（D-Nal，纯度：98%，批号：F2117074）（阿拉丁）；
D-瓜氨酸（D-Cit，纯度：98%，批号：C10929512，麦克林）；
3-（3-吡啶基）-L-丙氨酸盐酸盐（L-Pal，纯度：95%，批号：H2205521，毕得医药）；
L-瓜氨酸（L-Cit，纯度：98%，批号：LI20V67，百灵威）；
乙腈（色谱级，批号：21115279，TEDIA）；
甲酸（色谱级，批号：J2027128，阿拉丁）；
Nα-（2，4-二硝基-5-氟苯基）-L-亮氨酰胺（L-FDLA，色谱级，批号：K28OK-OQ，TCI）；
DMSO（色谱级，批号：EA617-CN，Honeywell）；
盐酸（分析级，批号：220707328F，南京化试股份有限公司）；
氢氧化钠（分析级，批号：20210813）、碳酸氢钠（分析级，批号：200523674X）（国药集团化学试剂有限公司）；
实验用水（杭州娃哈哈集团有限公司）；
醋酸西曲瑞克供试品（南京锐志生物医药有限公司，批号：XQRK-210801、XQRK-210901、XQRK-210902）。
2.1 色谱条件
色谱柱：Hedera ODS-2 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；
流动相：0.065%的甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱，洗脱程序见表1；
流速：1.0 mL·min－1；
柱温：35℃；
进样量：10 μL；
波长：340 nm。
表1 梯度洗脱程序Tab 1 Gradient elution program
2.2 质谱条件
电喷雾离子源（ESI），正离子模式采集；
喷雾电压：4000；
鞘气体压力：35 psi；
离子扫描气体压力：0.5 psi；
辅助气压力：5 psi；
毛细管温度：350℃；
套管透镜补偿电压：44 V；
源内碰撞解析电压：0 V；
碰撞压力：0 psi。
2.3 溶液配制
2.3.1L-FDLA溶液 取L-FDLA适量，加二甲基亚砜溶解制成约1.0 g·L－1的溶液。
2.3.2 手性氨基酸对照品溶液 精密称取组成醋酸西曲瑞克的10种氨基酸对照品适量，加适宜溶剂溶解，得到浓度为1.0 mmol·L－1的储备液。用0.1 mol·L－1的盐酸或0.1 mol·L－1的氢氧化钠溶液调节pH至7.0左右，最终得到浓度为40µmol·L－1的溶液。
2.3.3 手性氨基酸及对映异构体氨基酸混合对照品溶液 精密称取各氨基酸及其对映异构体对照品适量，加适宜溶剂溶解，得到浓度为0.5 mmol·L－1的储备液。用0.1 mol·L－1的盐酸或0.1 mol·L－1的氢氧化钠溶液调节pH至7.0左右，最终得到浓度为20 µmol·L－1的溶液。
2.3.4 供试品溶液 精密称取醋酸西曲瑞克适量，用6 mol·L－1的盐酸溶液溶解并稀释制成浓度为1.0 mmol·L－1的溶液，充氮后密封，置110℃烘箱中水解8.0 h后取出，放冷，启封，用2 mol·L－1的氢氧化钠溶液和0.1 mol·L－1的氢氧化钠溶液调节pH至7.0左右，最终得到浓度为40 µmol·L－1的溶液。
2.3.5 衍生化空白溶液 精密量取调节pH至7.0左右的水溶液125 μL置1.5 mL聚丙烯管底部，加入0.1 mol·L－1的碳酸氢钠溶液10 µL与1.0 g·L－1的L-FDLA衍生试剂100 µL，混匀，置37℃电热鼓风干燥箱中1 h后，取出，加入0.1 mol·L－1的盐酸溶液10 µL终止反应；
于离心机上12 000 r·min－1离心10 min，取上清液得到衍生化空白溶液。
2.3.6 衍生化操作 精密量取氨基酸对照品溶液125 μL置1.5 mL聚丙烯管底部，加入0.1 mol·L－1的碳酸氢钠溶液10 µL与1.0 g·L－1的L-FDLA衍生试剂100 µL，混匀，置37℃电热鼓风干燥箱中1 h后，取出，加入0.1 mol·L－1盐酸溶液10 µL终止反应；
于离心机上12 000 r·min－1离心10 min，取上清液得到衍生化对照溶液。衍生化供试品溶液、手性氨基酸及对映异构体氨基酸混合对照品溶液同法进行衍生化操作。
2.4 高效液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）鉴定与液相专属性
10种氨基酸衍生物LC-MS/MS鉴定结果见表2。
表2 正离子模式检测中10种衍生化氨基酸的相关参数和LC-MS/MS特性Tab 2 Related parameters and LC-MS/MS characteristics of 10 derived amino acids in positive mode detection
分别精密量取衍生化空白溶液、衍生化对照品溶液、衍生化供试品溶液和衍生化手性氨基酸及对映异构体氨基酸混合对照品溶液10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，结果显示组成醋酸西曲瑞克的10种手性氨基酸及其对映异构体不会受到空白干扰；
衍生化对照品溶液中，各氨基酸衍生物峰与相邻峰之间的最小分离度为1.19；
2份衍生化对照品溶液的含量匹配应在96%～105%；
第一份衍生化对照品溶液连续进样5针，各氨基酸衍生物峰校正因子RSD均不大于0.8%，表明进样精密度良好；
衍生化供试品溶液中，其他峰不干扰各目标氨基酸衍生物峰的测定；
该方法专属性良好，典型色谱图见图2。
图2 醋酸西曲瑞克水解后氨基酸含量测定的典型色谱图Fig 2 Typical chromatogram for content determination of amino acid after hydrolysis of cetrorelix acetate
2.5 检测限和定量限
精密移取“2.3.2”项下氨基酸对照品溶液，逐级稀释合适倍数后同“2.3.6”项下进行衍生化处理后进样，分别将信噪比（S/N）≥3和10的浓度作为检测限（LOD）和定量限（LOQ）（见表3）。结果10种氨基酸衍生物的LOD和LOQ的浓度均分别为0.68 µmol·L－1和2.04 µmol·L－1。取LOQ浓度衍生化溶液连续进样6针，氨基酸衍生物峰面积RSD＜4.2%，保留时间的RSD＜0.20%，结果表明定量限测定精密度良好。
表3 10种氨基酸衍生物的LOD与LOQ的信噪比Tab 3 LOD and LOQ of 10 amino acid
2.6 线性与范围
精密移取“2.3.2”项下氨基酸对照品储备液，依次制备成10.20、16.33、20.41、22.45、24.49µmol·L－1系列浓度的线性测试溶液。照“2.3.6”项下方法分别进行衍生化处理，进样分析，以峰面积为纵坐标，摩尔浓度为横坐标，作图并进行线性回归，结果表明组成醋酸西曲瑞克的10种氨基酸衍生物在10.20～24.49 µmol·L－1与峰面积线性关系良好，r值均大于0.991。
2.7 重复性与中间精密度试验
按“2.3.5”和“2.3.6”项下方法分别配制衍生化空白溶液、衍生化对照品溶液及平行6份衍生化供试品溶液，进行重复性考察，结果组成醋酸西曲瑞克的10种氨基酸衍生化后的含量RSD在0.41%～0.90%，表明重复性良好。不同分析人员在不同日期重复上述试验，考察方法中间精密度，结果组成醋酸西曲瑞克的10种氨基酸衍生化后含量RSD在0.23%～1.6%。精密度试验中组成醋酸西曲瑞克的10种氨基酸衍生化后含量RSD在0.46%～5.8%，表明方法中间精密度良好。
2.8 稳定性试验
按“2.3.6”项下方法分别配制衍生化空白溶液、衍生化对照品溶液及衍生化供试品溶液，于室温放置0、11、14、17、22、40 h后进样分析，记录各氨基酸衍生化后的峰面积并计算供试品中各氨基酸衍生物的含量。结果显示对照品溶液中组成醋酸西曲瑞克的10种氨基酸衍生化后的峰面积RSD均低于1.8%；
水解供试品溶液中10种氨基酸衍生后产物的含量RSD均低于1.8%，表明在40 h内溶液稳定性良好。
2.9 耐用性考察
改变流动相中甲酸添加量（%）、流速（mL·min－1）、柱温（℃）以考察环境的微小变动对方法测定结果的影响，结果发现在各个色谱条件下10种氨基酸的检测均不会受到干扰，衍生化对照品溶液中，各氨基酸校正因子RSD均低于2.7%，峰与峰之间的最小分离度均不小于1.0；
各条件下供试品溶液中各氨基酸含量的RSD均低于6.9%，方法耐用性良好，具体结果见表4。
表4 耐用性结果Tab 4 Durability test
2.10 样品检测
分别取3批醋酸西曲瑞克样品（批号：XQRK-210801、XQRK-210901、XQRK-210902）进行检测，结果各批次组成醋酸西曲瑞克的10种氨基酸衍生物含量均在83.5%～109.5%内，见表5。
表5 10种氨基酸在3批醋酸西曲瑞克供试品中的检测结果(%)Tab 5 10 amino acids in 3 batches of cetrorelix acetate (%)
3.1 衍生条件的选择
对影响L-FDLA与氨基酸反应的因素进行了考察。分别在37、50、60℃下反应相同时间，或在相同温度下分别反应0.5、1.0、1.5 h，结果显示反应温度越高，衍生物峰面积越大，但是温度高于37℃后，衍生试剂产生的杂质会显著干扰样品峰的测定，在37℃左右反应1.0 h时没有明显干扰；
反应时间越长衍生物峰面积越大，考虑到试验效率结合文献[11]已报道的方法（Marfey试剂在与L型与D型氨基酸的α-氨基在40℃碱性条件下反应1 h后，不会产生外消旋产物），决定反应时限定为1.0 h。对10种氨基酸总摩尔之和与L-FDLA的用量摩尔比（1∶1～1∶10）进行考察，结果显示摩尔比在1∶5左右时即可达到最大产率。
3.2 水解条件摸索
取醋酸西曲瑞克的6 mol·L－1盐酸溶液，分别在110℃加热4、6、8、12、24 h后测定。结果选取多数氨基酸能较大程度水解且变化趋势较平稳的8 h作为水解终点时间。在8 h时，组成醋酸西曲瑞克的10种氨基酸外消旋化程度小，结果见图3。
图3 醋酸西曲瑞克水解时间与衍生化产物峰面积的关系Fig 3 Relationship between hydrolysis time and peak area of derivatization products
3.3 色谱条件的选择
在C18色谱柱上考察了不同流动相系统对醋酸西曲瑞克水解产生的氨基酸衍生物的分离效果。结果以甲醇-水系统作为流动相时部分氨基酸有拖尾现象，且分离度小于1.0；
改用乙腈-磷酸盐系统作流动相时，调节pH、柱温、梯度或者更换色谱柱都无法使所有氨基酸分离度均大于1.0；
最终选取乙腈-甲酸水体系，甲酸添加量为0.065%左右时，能使所有氨基酸达到良好的分离效果，且峰形良好。
3.4 质谱结果讨论
瓜氨酸每种构型都产生的两个杂质衍生产物峰m/z（M＋H）＝427.18，符合鸟氨酸衍生后分子量，推测反应过程见图4A；
酪氨酸产生的保留时间约46.0 min的副产物峰m/z（M＋H）＝770.77，符合酪氨酸双衍生物的分子量，见图4B，该产物与文献报道结果相符[12]。此外，衍生试剂产生的最大副产物m/z（M＋H）＝313.10，推测是L-FDLA的氟原子在碱性条件下水解为羟基形成的化合物，见图4C。
图4 4种鸟氨酸衍生物（A）、酪氨酸双衍生物（B）与衍生试剂水解产物（C）示意图Fig 4 Schematic diagram of 4 ornithine derivatives（A），Bis-Mar-Tyr（B），and hydrolysate of L-FDLA（C）
3.5 含量测定结果讨论
D-Cit衍生物含量测定结果偏差较大，推测是D-Cit在水解条件下被破坏成了鸟氨酸而产生损失；
D-Phe偏差较大的原因暂且未知；
其他氨基酸衍生物含量在90%～110%内，无明显异构体产生。
3.6 总结与展望
本文建立了一种能够排除对映异构体氨基酸的干扰从而准确测定醋酸西曲瑞克产生的10种手性氨基酸含量的方法；
该方法高效、简便，仅用液相色谱系统结合普通C18色谱柱就能完成测定，可为多肽药物的手性氨基酸含量测定提供参考。
