温彩怡，江 飚，孙龑鑫，黄伟民，马 壮，梁芝源，刘 春，胡 雄，苏友禄
（1.仲恺农业工程学院动物科技学院/健康养殖创新研究院，广东 广州 510225；
2.佛山市顺德区活宝源生物科技有限公司，广东 佛山 528300）
【研究意义】杂交鳢（Hybrid snakehead）属鲈形目（Perciformes）、攀鲈亚目（Anabantoidei）、鳢科（Channidae）、鳢属（Channa）［1］，是以斑鳢（Channa maculata）为母本、乌鳢（Channa argus）为父本，通过杂交获得的子一代，俗称生鱼、黑鱼、财鱼等。杂交鳢不仅具有生长速度快、适应性强、耐运输、耐低氧、生长性状好、成活率高等优点，而且肉质鲜美、营养丰富，有滋补调养等药用价值，深受消费者喜爱［2-5］，已成为我国重要的特种经济鱼类之一。2022 年杂交鳢养殖年产量高达54.85 万t，同比增长约10%［6］。自然状态下的杂交鳢抗病力强，极少发病，但由于养殖密度增大、水质富营养化和种质资源退化等原因，导致杂交鳢病害逐年递增暴发［7-9］。近年来，杂交鳢弹状病毒（Hybrid snakehead rhabdovirus,HSHRV）频繁检出，其可感染杂交鳢亲本、鱼苗和不同养殖规格的杂交鳢，已成为制约杂交鳢养殖产业可持续发展的重要因素［10］。开展HSHRV流行病学调查分析对杂交鳢养殖与病害防控具有重要的指导意义。
【前人研究进展】弹状病毒（Rhabdovirus）是一类有包膜的单股负链 RNA 病毒，其种类较多，在自然界中分布广泛，多数具有很强的致病性［11］。HSHRV 粒子直径约60 nm，长度为160 nm，形态似椭圆形或圆形，通常具有5 种主要结构蛋白（L、G、N、P 和M）［12-13］。曾伟伟等［10］发现HSHRV 与鳜鱼弹状病毒（Siniperca chuatsirhabdovirus,SCRV）、鲤春病毒血症病毒（Spring viremia of carp virus,SVCV）等聚为一支；
雷燕等［13］分析发现，大口黑鲈弹状病毒（Micropterus salmoidesrhabdovirus,MSRV）与HSHRV、SCRV核苷酸序列同源性分别为 96.9%和95.3%，推测HSHRV可能为MSRV 和SCRV的变异株。HSHRV 曾被归属于水泡病毒属（Vesiculovirus），但根据国际病毒分类学委员会2022 年最新分类结果显示，弹状病毒被分为45 个属共265 种，但仍有多种弹状病毒未被纳入分类，其中包括MSRV和HSHRV，而与其同源性较高的SCRV 则归为Siniperhavirus属［14］。弹状病毒病在发病初期缺乏典型临床病症，且无防治特效药，因此对杂交鳢弹状病毒的快速、精准诊断尤为重要。病毒的检测方法主要包括细胞学、组织病理学、免疫学和分子生物学等，qPCR 因具备特异性强、灵敏度高、快捷高效等优点，已成为水产病原检测的常用技术［15］。梁红茹等［16］利用双重PCR 方法可特异检测出弹状病毒；
而刘春等［17］基于杂交鳢弹状病毒的G 蛋白序列构建了TaqMan qPCR 检测方法，不仅特异性强、灵敏性高，还极大节省时间，非常适合杂交鳢弹状病毒的临床检测。【本研究切入点】珠三角地区主要养殖的杂交鳢、大口黑鲈、鳜鱼等名特优水品种产量居全国首位，且均为弹状病毒的易感宿主。近年来，广东省佛山市、中山市和江门市的杂交鳢主要养殖场频繁暴发弹状病毒病，引起巨大的经济损失。虽然珠三角地区杂交鳢养殖规模不断增大，但杂交鳢感染弹状病毒的流行病学仍缺乏全面系统的调查与分析。基于此，本研究对珠三角地区的杂交鳢弹状病毒进行完整周年的监测，以进一步了解该病毒的感染情况。【拟解决的关键问题】本研究从2021 年3 月至2022 年2 月对珠三角地区养殖的杂交鳢进行监测，从不同养殖时间和不同规格的宿主角度分析弹状病毒阳性率变化，以期探明HSHRV 在杂交鳢不同养殖阶段的流行规律，为杂交鳢弹状病毒病的综合防治提供参考。
1.1 试验材料
1.1.1 样品采集 样品采集时间为2021 年3 月至2022年2月，于珠三角地区（中山、佛山和江门）疑似染病的杂交鳢养殖场随机采集繁育阶段的杂交鳢亲本、鱼苗、水样以及不同养殖阶段的鱼体，共采集333 份样品（每尾鱼的肝脏、脾脏和肾脏混合成1 份样品，共292 份；
繁育阶段每池水样为1 份样品，共8 份；
每20 尾鱼苗混为1 份样品，共33 份）。杂交鳢样品均经无菌解剖后采集肝脏、脾脏和肾脏组织置于同一冻存管中，迅速放入液氮中冷冻后置于-80 ℃冰箱保存备用。
1.1.2 主要试剂 大肠杆菌DH5α 感受态细胞、DNA 凝胶回收试剂盒购于北京擎科生物有限公司，FastPure® Plasmid Mini Kit 购于南京诺唯赞生物科技有限公司，动物组织总RNA 提取试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司，TransScript® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix购于北京全氏金生物科技有限公司，2×M5 HiPer plus Taq HiFi PCR mix（with blue dye）购于北京聚合美生物科技有限公司，pMD-18T质粒、T4连接酶、DL2000 Marker、Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）购于宝生物工程（大连）有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 RNA 提取与反转录 分别取样品约100 mg，采用动物组织总RNA 提取试剂盒提取组织总RNA，随后利用TransScript® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 试剂盒进行反转录，合成cDNA 模板。
1.2.2 qPCR 检测 参照刘春等［17］建立的弹状病毒TaqMan 实时荧光定量（qPCR）检测方法，委托广州天一辉远生物科技有限公司合成引物和探针（引物1∶P1∶5’-CGCGGATCCATCATGAAATCA ATCATTGCACT-3’，P2∶5’-CATCTGCAGAATTGAT ACTGCTGCAAAGGG-3’；
引物2：HSHRV-2F∶5’-CACCAGTCATATCAATCC-3’，HSHRV-2R∶5’-CGGACTTAAACCTCATTC-3’；
探针：HSHRV-2PFAM-ACCTCTCCGCACATTGACATCT-BHQ1）。采用G 蛋白引物P1、P2 分别对合成的cDNA 模板进行 PCR 扩增并构建重组质粒。
取cDNA模板进行qPCR 检测，20 μL 反应体系为：2×Premix Ex TaqTM10 μL，10 μ mol/L HSHRV-2F 与HSHRV-2R引物各0.4 μL，10 μmol/L HSHRV-2P 探针0.8 μL，cDNA 模板1.6 μL，ddH2O 6.8 μL。同时设重组质粒为阳性对照、ddH2O 为阴性对照。使用CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad）进行扩增反应；
反应程序为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃延伸30 s，循环40 次，在每个循环的60 ℃处采集FAM 荧光信号。
1.2.3 数据处理与分析 病毒检测阳性评判标准：Ct 值≤35 为阳性；
Ct 值＞35 或显示为N/A，且没有特异性扩增曲线则判定为阴性。所有数据的图表绘制使用GraphPad 9.0 和OriginPro。
2.1 不同规格杂交鳢感染弹状病毒的临床症状
本研究根据体长将杂交鳢分成3 种规格：小规格体长为1～10 cm，中规格体长为11～20 cm，大规格体长＞20 cm。不同规格杂交鳢感染弹状病毒后均表现游动异常，小规格杂交鳢出现打转症状比例较高（图1A），而中规格和大规格杂交鳢出现此症状的比例明显减少（图1E）。解剖后发现小规格鱼体的脏器发红，但肿大症状不明显；
而中规格和大规格鱼体的内脏器官普遍充血和肿大（图1B、C、F），且中规格鱼体肠道充血、发炎（图1D）的比例高于小规格鱼，还可在大规格鱼体中观察到鱼鳔充血和出血现象（图1G）。
图1 不同规格杂交鳢感染弹状病毒的主要临床症状Fig.1 Main clinical symptoms of rhabdovirus disease in different sizes of hybrid snakehead
2.2 不同养殖阶段杂交鳢弹状病毒感染情况
qPCR 检测结果显示，333 份样品的HSHRV平均阳性率为13.21%，其中，92 份繁育阶段样品的平均阳性率较低、为3.26%，亲本和水样均未检出HSHRV，鱼苗阳性率为9.10%；
241 份养殖阶段样品的平均阳性率为17.01%，明显高于繁育阶段（表1）。
表1 不同养殖阶段杂交鳢弹状病毒感染情况Table 1 Infection of HSHRV in different culture stages of hybrid snakehead
2.3 不同养殖时间杂交鳢弹状病毒感染情况
从季度角度分析，HSHRV 阳性率呈现先升后降的趋势（图2），阳性样品主要在春季和夏季检出；
其中，春季样品的阳性率为16.98%，而夏季样品的阳性率则高达21.78%，秋季样品阳性率降到13.33%，冬季未检出阳性样品，这可能与冬季样品量相对较少有一定关系。
图2 不同养殖季节杂交鳢弹状病毒阳性率Fig.2 Positive rates of HSHRV in different culture seasons of hybrid snakehead
从月份角度分析，HSHRV 阳性率表现为4－8 月份不断增长，但从10 月份开始（11 月除外）多个月份未检出阳性样品。月份流行趋势与季度流行趋势大体一致，为先升后降。进一步分析发现，不同养殖月份的HSHRV 阳性率存在一定差异，3 月、6－8 月和11 月的HSHRV 阳性率均≥20.00%，其中，8 月份样品的阳性率最高（23.91%）；
4 月、5 月和9 月的HSHRV 阳性率较低，介于10.00%～ 20.00%；
总体来看，4 月、6－9 月平均Ct 值较低，病毒载量较高，其中4 月Ct值最低，为21.41；
10 月、12 月至次年2 月均未检出阳性样品（表1）。
2.4 不同规格杂交鳢弹状病毒感染情况
从不同规格的杂交鳢HSHRV 检测结果来看，小规格杂交鳢的HSHRV 感染率最高、平均阳性率为32.20%，中规格杂交鳢的H SHRV 感染率次之（22.86%），大规格杂交鳢的HSHRV 感染率最低（9.52%）（图3A）。从感染的月份来看，小规格杂交鳢的HSHRV 主要在3－9 月检出，阳性率从3 月开始逐月增加，8 月阳性率最高、达71.43%，而从10 月至次年2 月均未检出该病毒；
中规格杂交鳢的HSHRV主要在6－9月、11月中检出，其中，6 月、8 月和11 月阳性率均为33.33%，7 和9 月样品阳性率分别为22.22%和9.10%；
大规格杂交鳢在春季与秋季HSHRV 阳性率较高：3、4 和11 月阳性率较高，分别为28.57%、16.67%和20.00%，而夏季阳性率较低，7－ 9 月阳性率分别为6.67%、12.12%和7.40%（图3B）。
图3 不同规格杂交鳢弹状病毒阳性率Fig.3 Positive rates of HSHRV in different sizes of hybrid snakehead
弹状病毒可感染多种鱼类，并且感染后出现不同的临床症状。滕建等［8］研究发现弹状病毒可导致杂交鳢肝脏、脾脏肿大，鱼鳔血管严重肿胀和出血等病变；
大口黑鲈感染弹状病毒后出现游动不规则、烂身、“花肝”和肾脏肿大现象［18-19］。Fu 等［20］发现，鱼类感染弹状病毒后主要症状为出血性败血症，影响多种器官的功能。本研究发现，杂交鳢感染弹状病毒后表现出类似的上述临床症状，但不同规格杂交鳢感染弹状病毒后呈现一定差异：小规格杂交鳢主要出现不规则螺旋状翻转，解剖症状不明显；
而中、大规格杂交鳢主要表现脏器充血发红或肿大，且多伴有肠道发炎现象。
弹状病毒在不同地区和不同品种的鱼类上的检出情况有一定差异。2014 年和2015 年，全国多种名特优养殖鱼类的弹状病毒平均阳性率分别为18.29%和12.29%，其中，杂交鳢弹状病毒平均阳性率最高，分别为27.98%和34.01%，大口黑鲈弹状病毒的平均阳性率分别为6.19%和12.24%［21］。2007 年和2018 年，北京市和上海市地区SVCV 阳性率分别为4.16%和14.4%［22-23］；
林强等［24］2016 年3－11 月对广东省鳜鱼养殖场进行病毒病监测，发现SCRV 阳性率高达20.42%。本研究检测结果显示，HSHRV 平均阳性率为13.21%，高于SVCV 在其他鱼类中的阳性率。
王娟等［21］发现，鱼类弹状病毒在 4－12月皆有检出，其中12 月份的平均阳性率高达71.43%，而夏季的阳性率普遍低于10%。本研究与上述研究结果存在一定差异，而与黄志斌等［25］对珠三角地区鳜鱼病害调查结果较一致，即每年11 月中下旬水温降低后死亡率大幅度下降。弹状病毒在25～28 ℃ 时稳定性高，对鳜鱼、斑马鱼等具有较强的感染能力［26-27］。本研究结果显示，HSHRV 在春夏季节的检测Ct 值较低，表明春夏季节病毒载量较高，这与大多数研究学者的结果一致。
本研究发现，繁育阶段的样品中，只有鱼苗检测出HSHRV，这可能与刚孵化的鱼苗自身免疫力低，因此更容易感染弹状病毒有关。但鱼苗检测Ct 值较高，表明鱼苗携带弹状病毒载量很低，且未在杂交鳢亲本中检测出HSHRV，可能与繁育过程中注重筛选免疫力强、活力好的亲本有关。同时，本研究结果显示，HSHRV 最易感体长10 cm 以下的鱼苗，而对20 cm 以上的大规格鱼感染率较低。也有研究发现MSRV 可引起体长2～4 cm和更小规格（体长0.8～1 cm）的大口黑鲈幼鱼死亡［28-30］；
SVCV 对大规格鲤鱼的感染率很低［31-32］，这与鱼对弹状病毒的抵抗力随年龄增加而上升有一定关系［33］。人工感染斑鳢的结果表明，规格越大的亲本感染弹状病毒后，鱼体的死亡时间越慢［34］，随着鱼体规格增大，机体代谢更加旺盛，其免疫力逐渐提高。与上述研究类似，本次调查的中规格和大规格杂交鳢弹状病毒阳性率呈现大幅度下降的趋势。
本研究对珠三角地区杂交鳢弹状病毒进行了周年监测，以明确感染弹状病毒的主要流行症状。患病杂交鳢体表症状不明显，小规格鱼出现打转现象，解剖症状不明显；
中规格鱼主要表现为肝脏、脾脏充血发红以及肠炎；
大规格鱼则主要表现为脾脏和鱼鳔充血发红和肿大现象。本次调查结果显示，杂交鳢弹状病毒的平均阳性率在13%左右，养殖阶段的平均阳性率（17.01%）显著高于繁育阶段的平均阳性率（3.26%）；
该病毒病主要流行于4—11 月份，夏季阳性率最高，冬季未检出阳性样品；
该病毒最易感体长10 cm 以下的小规格杂交鳢，而大规格杂交鳢弹状病毒阳性率低于10%。
